细胞培养常见问题（一）

1.如何判断细胞株有支原体污染？

    细胞培养过程中，最常见的污染是支原体污染，一旦发现有下列情况，应怀疑细胞已被支原体污染：
  1.培养基过早变色（变黄）。
  2.细胞生长率明显下降，生长缓慢，破碎细胞多。
  3.悬浮细胞特别容易成团。
  4.细胞形态发生改变，细胞间隙大。
  5.只有频繁改善培养环境，才能继续传代。
    为了确保实验的严谨性，建议选择支原体检测试剂盒进行支原体污染的检测。

2.支原体污染会对细胞培养有何影响？

    支原体污染几乎可影响所有细胞的生长参数、代谢及研究的任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为mycoplasma-free，实验结果的数据方有意义。

3.检测出细胞株有支原体污染时， 该如何处理？

   支原体污染细胞后，特别是重要的细胞株，有必要去除支原体。由于支原体没有细胞壁，故作用于细胞壁生成的抗生素是不敏感的，而且，抗生素对细胞有毒性，容易产生耐药性。
目前，市场上已有支原体去除试剂盒，利用生物物理方法快速杀死支原体，且无毒无耐药，从而达到永久去除支原体的目的。

4.血清解冻后发现有絮状沉淀物出现，该如何处理?

    血清中沉淀物的出现有许多种原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成，而血纤维蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解冻后，也会存在于血清中，亦是造成沉淀物的原因之一。但这些絮状沉淀物，并不影响血清本身的质量。
若欲去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管内，以400转/分离心1-2分钟,上清液即可接着加入培养基内一起过滤。最好不使用过滤的方法去除这些絮状沉淀物，因为它可能会阻塞过滤膜。在解冻血清时，建议随时将血清摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。

5.为什么储存在冰箱中的胎牛血清会出现沉淀?

    胎牛血清储存在2－8℃时，血清中的各种蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。这不会影响血清的质量。推荐在－20℃储存胎牛血清，避免反复冻融。

6.如何避免沉淀物的产生?

  1 解冻血清时，按照建议逐步解冻，若解冻时改变的温度太大(如-20℃至37℃)，非常容易产生沉淀物
  2 解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。
  3 请勿将血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量。
  4 血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，无须做此步骤。
  5 若必须做血清的热灭活，请遵守40℃，20分钟的原则，并且随时摇晃均匀。温度过高，时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉淀物的增多。

7.血清、培养基及其它添加物和试剂可反复冻融吗？

    血清、培养基及其它添加物和试剂不可反复冻融，如果冻融次数增多，都会使包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，从而影响它的性能。

8.细胞培养中出现黑点是污染吗？如何处理？

    一旦您在细胞培养的过程中发现有黑点生成，首先，要肉眼观察培养基是否混浊，然后，在镜下观察培养细胞生长的状态，黑点是否游动。如果，细胞被污染，细菌则会大量繁殖，培养基就会迅速变黄、变混浊。

    如果，在镜下观察细胞，生长状态良好，与黑点出现前相比，没有任何变化，那么，黑点的出现可能与以下几种情况有关：
（1）细胞生长过老，破碎的细胞残骸；
（2）血清质量不好，反复冻融的结果；
（3）配制培养基的PH值偏高，不宜细胞生长；
（4）配制培养基的水质、容器不合格。可应用离心、过滤的方法去除这些黑点。

9.细胞培养中如何防止黑点生成？

（1） 尽可能地减少血清冻融次数。
（2） 培养基无需37℃水浴。
（3） 培养基保持最佳PH值7.0- 7.2。
（4） 严格控制配制培养基的水质，容器定期刷洗。
（5）掌握细胞传代的最佳时机，细胞切勿生长过老。

10.何谓内毒素？它的作用是什么？

     内毒素（Endotoxin）是革兰氏阴性菌的细胞壁外壁层上的特有结构。细菌在生活状态时不释放出来，只有当细菌死亡自溶或粘附在其它细胞时，才表现其毒性，内毒素的主要化学成分是脂多糖中的类脂A成分。内毒素直接参与细胞凋亡，血清中内毒素含量越低，对细胞毒性越小，越利于细胞的生长和传代；内毒素含量过高,会直接导致细胞提前老化。因此，血清应进行内毒素水平的检测，国际上规定，胎牛血清的级别应以内毒素水平的高低来确定，其中，特级胎牛血清的内毒素应<10 UI/ml。

11.L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定吗？

    L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是，确切的降解率一直没有最终确定。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。

12.血清融化推荐方法

注意：

  1.在水浴过程中，血清的平面要完全浸在水中。在融化过程中要慢慢摇动，使血清混匀，但不要产生泡沫。
  2.若必须做血清的灭活，请遵守40℃，20分钟的原则，并且随时摇晃均匀。