细胞大规模培养要素控制及其参数的测定
(一)细胞数量的测定:采用常规细胞计数法测定细胞总数及活细胞数，并计算细胞存活率。
(二)细胞活性的测定:
1、直接测定:
计数法中的细胞存活率的测定虽能显示细胞的生长活力，但误差大，故常采用MTT法或3H-TdR掺入法可准确地显示细胞的代谢状态和生长繁殖的活力。
2、间接测定:
细胞活性间接测定法是基于测定细胞代谢活性之上的。最为普通的参数是葡萄糖的利用及生物氧化后的代谢产物，如乳酸或丙酮酸产物等。
(三)培养要素控制
1、容器生长表面的选择和处理(静置贴壁培养)
细胞培养容器的生长表面为玻璃、不锈钢(或钛)、塑料表面。玻璃应选用明矾-硅硼酸钠玻璃(例如Pyrex)，反复使用会减少细胞的贴壁，用1mmol/L醋酸镁处理能获恢复；塑料表面常用聚苯乙烯，此外还可用聚乙烯多聚碳酸盐、Perspex、PVC聚四氟乙烯(Teflon)玻璃纸及醋酸纤维素等，经正确预处理后都是合适的。不锈钢(或钛)对细胞生长是合适的，但处理和清洗时要用酸洗(10%硝酸、3.5%氟氢酸、86.5%水)以利除去表面污物。
为了利于细胞贴壁，培养表面要求使用糖蛋白和/或二价阳离子(Ca++、Mg++)交联，研究最多的糖蛋白为纤粘素。培养表面也可用胶原以及多聚氨基酸覆盖壁表面。胶原可以购买（Vitrogen100,F10w实验室），胶原在生长表面对细胞生长有利，也可用于覆盖微载体小珠表面（Cytodex3,Pharmawa Fine Chemicals）。
2、悬浮培养基中的添加剂
(1)通常将羟甲基纤维钠(纤维素)(5～20e.p.s)加入悬浮培养基中(0.11%浓度)以防止搅拌、通气和灌注时对细胞产生机械损伤(预先应做毒性预试验)。
(2)通常将pluronic F=68(polyglgcol)(BASF,wyandot)消泡剂加入培养液中(0.11%浓度)，可防止血清在搅拌通气中产生泡沫，此物质也可阻止细胞贴壁(预先应做毒性预试验)。
3、培养条件
（1）温度 适宜温度为37℃，通常选择36℃±0.5上下波动进行控制，培养液要事先预温，以利细胞适应环境。
（2）pH 理想的pH值为7.2，开始培养时pH值可略低一些，次日细胞开始快速生长时可将pH调至7.4已进行控制，常加入Hepes以稳定pH。
（3）细胞生长期的选择应选择细胞对数生长期后期的细胞接种培养，以利细胞生长繁殖。
（4）接种细胞密度 细胞接种密度要根据细胞系种类的特性以及培养基而定，指导浓度为5×104～2×105细胞/mL或5×103～2×104细胞/mL。
（5）搅拌速度 不同细胞应通过实验找出合适的搅拌速度，对于悬浮细胞可用100～500r/min，通常在200～350 r/min 之间，而微载体培养细胞通常使用20～100 r/min 范围之内。
4、培养基和营养物质的选择
悬浮培养常用Eagle(BME或MEM)血清成分为2～5%，但谷氨酰胺需不断补充，同时可补充胱氨酸、精氨酸，培养2～3天后还应补加葡萄糖以利细胞稳定生长，若为了加速生长可在培养基中加入适量生长因子、激素等，如：胰岛素（5mg/L）、转铁蛋白（5～35mg/L）、胆胺（20μmol/L）及硒（5μg/L）等,Ca++、Mg++应尽量降低，以防细胞结团、贴壁、下沉，也可采用补加胰蛋白酶（2mg/L）可以克服。
5、培养系统的控制
(1) pH调控系统
不同培养液其缓冲系统不同，Eagle BSS(含25mmol/L NaHCO3)要选用5%CO2来平衡（通气口均安装气体过滤器，以防污染），培养系统中常安装有经高压灭菌的pH 检测探头，将信号输入控制器，然后换成数字或类似的pH 显示，这是一种pH 监测系统，pH 调节是由pH 值调控板上的高或低点的接点，接通后能起动泵或螺线管活塞上的中继器，使酸或碱(5.5%NaHCO3)自动加入培养液中以调整pH ，加入时应提高搅拌速度，以防局部浓碱损害细胞，在通常情况下是通过调节5%CO2/95%O2的比例来调节pH ，为了使pH 保持较高的缓冲能力。通常加入Hepes。
（2）通气调控系统
正常情况下氧只溶于培养液中（7.6mg/L），而106细胞1小时平均耗氧6μg，这样培养液中的溶介氧若接种106细胞，1小时就会耗尽，因此在1L大瓶的密闭培养时，培养上方的空间与培养液的比率为10:1（如Roux瓶）以提供足够的氧，即在Roux大瓶中有900mL空气和100mL细胞培养液，开始氧的含量是0.27g（见表3-1），这样的含氧量可以支持108细胞生长450小时，显然是很合适的。气态氧向溶液中溶解，氧弥散到细胞的速率大约是1.5μg/cm2/h，以此速率足以能支持1L瓶中50×106细胞对氧的需求。由此可见维持较大的上方空间是很重要的。
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