细胞大规模培养的类型和方法（一）

    近年来细胞工程的相关技术发展十分迅速，尤其是在实际应用和生产工艺上获得了可观的成就，当前人们已经能够通过大量细胞培养的细胞工程，生产多种单克隆抗体、激素、细胞因子、病毒疫苗和具有特殊功能的效应细胞等。因实验室采用的细胞培养技术获得的细胞量有限，不能满足生产的需求，必须改用超产培养技术方可获得大量细胞，目前这种技术种类繁多，归纳起来有三大类：(1)单层静置贴壁培养法；(2)悬浮培养法；(3)固定化培养法。这些超产培养技术通常是研究开发机构及生产性企业常采取的方法，在我国已开始进入研究和试生产阶段，各大生物制品研究所及生化制药和生物工程公司的制药企业，根据生产需要而采用了切实可行的不同方法和技术设备。下面介绍一些有关细胞大量培养的方法（如图），在实际应用和生产实践中可根据需要来选择下列细胞大量培养的方法。

一、大规模培养系统的类型。

    为了获得大量的细胞常采用批量和连续的培养系统。细胞接种在固定体积的培养液中，由于细胞生长营养物的耗尽和代谢产物的积累，细胞最终会停止生长繁殖，使细胞的密度受到了限制。为了延长细胞的生长周期，采用添加或更换培养液，或扩大培养体积，可增加细胞的产量。常采用如下措施。
  (1)逐渐加入新鲜的培养液，故增加培养体积(批量换液)。
  (2)使用等量新鲜的培养液间隔地更换部分旧培养液成分(半连续批量培养系统)。保留下来的部分旧液不仅对细胞生长无害，有时还有利于细胞更适应环境。
  (3)用连续灌注法加入培养液。将回收使用过的无细胞等量培养旧液，先经过第二容器，并在第二容器中经通气和pH校正处理后，形成“再生”的培养液，然后再反回进入原细胞培养器中。
  (4)连续-流动培养系统
这一系统是当接种的细胞在固定体积的培养容器中培养，直至生长到限制营养所能支持的最大数值，即培养至“稳定状态”时(此时细胞数和营养浓度保持恒定)，此时将细胞悬液流入恒浊器。恒浊器装有细胞密度（浊度）光电测定仪，当密度低于预定点时，储罐中培养液的供应便停止，细胞不断增殖。当细胞密度高于预定点时，则输入培养液洗出过剩的细胞，这种调控法均在细胞达最大生长率时进行操作，这种连续-流动培养系统可得到真正内环境稳定的条件，而且又没有营养、代谢或细胞数量的波动，可使细胞一直处于对数生长期状态，其生产规模可呈无级连续扩大。

二、大规模生产细胞的方法

    大规模生产细胞的方法多种多样，鉴于细胞的生长特性不同（贴壁或悬浮生长）和生产的目的不同，常采用三种生产方式：(1)单层静置贴壁培养法；(2)固定化培养法；(3)悬浮培养法。在这三种生产方式中，又可采用不同的生物反应器来生产细胞。

  (一)单层静置贴壁培养法

    此方法是使细胞静置贴在容器壁表面，并不断地生长繁殖而形成单层。在显微镜下可直接观察到细胞的形态，这样有利于研究形态学的变化，如病毒感染后出现的细胞病理性改变(CPE)，放射线或抗癌药物引起的细胞形态变化及细胞诱导分化的形态改变等。几乎各种细胞，包括原代、传代细胞系(株)，均能进行培养，其优点为：

  (1)单层细胞培养比较容易完全换液，而且细胞清洗方便，无需离心。
  (2)便于直接观察细胞的形态和生长状态。
  (3)便于采用灌注技术，以达高密度细胞培养的目的，固无需采用细胞过滤系统(为了截留细胞用)。
  (4)当细胞贴壁于基质，能有效地表达一种产品。
  (5)同一装备可使用不同的培养液/细胞的比例，在进行实验期间这一比例可容易地加以改变。
  (6)单层细胞培养较易适应环境，可用于培养所有的细胞类型。

但单层细胞培养法与悬浮细胞培养法相比也有以下缺点：

  (1)传代、扩大培养比较困难，生产规模受限制。
  (2)细胞取样、计数较困难。
  (3)在测定和控制pH和O2以及细胞完全同质性是比较困难的。
  (4)占用的空间大。
  (5)所用培养瓶(管)因瓶(管)口多，传代换液需开口操作，容易发生污染。

1、转管及转瓶培养

    转管培养法(roller tube culture)是Gey提出的，实验室常用，为了扩大细胞产量，将试管改用转瓶，故称转瓶培养，其培养方法是一样的，试管或转瓶固定在支加上，倾斜度为5°～10°左右，或将转瓶放在一排排转轴之间，使转瓶随着转轴以每小时6～12转缓慢转动。细胞贴附于玻璃壁四周，细胞贴壁和生长只有一个表面面积，经转动一方面使培养液流动，利于细胞吸收营养和进行代谢，一方面使细胞有机会接触气体，有利于细胞呼吸和发生氧化还原作用，有利于细胞生长繁殖。培养瓶(管)内保持有相当大的上方空间，以维持合适的氧和pH 水平，通过转动可使细胞交替接触培养液和空气，营养可被充分利用。若需增加细胞产量，除可在增加转瓶的数量和容积外，使瓶直径尽可能小，此时表面面积可因直径或长度的倍增而成倍增加。
转瓶培养也可使用灌注培养系统，因此系统需要错综复杂回旋的可连续供应的管道进入瓶内，这是一种昂贵的选择。
[实验程序]：

本程序是在1400cm²(23×12cm)一次性塑料瓶上使用的(Corning或Becton Dickinson)程序。

  (1)加入300ml生产培养液于转瓶中。
  (2)加入1.5×10⁷细胞。
  (3)在37℃下，以12转/小时，转动2小时，使细胞均匀贴壁。
  (4)减少转动速度至5转/小时并连续培养。
  (5)在倒置显微镜下使用长焦距物镜检查细胞。
  (6)在细胞生长至明显汇合时(5～6天)，移出培养液，加入0.25%胰蛋白酶，并滚动转瓶以收获细胞。洗去胰蛋白酶，加入新鲜培养基，可转入扩大再培养。为了增加表面积，有人将转瓶表面制成带皱纹的表面或插入多层隔板。以增加表面积。

2、旋转圆柱管培养

    这个系统是Stantere首先提出并由Corbeil发展的，这是一种用小玻璃管束平行排列包裹在圆瓶内（用硅隔离环隔开），由一个多岐管与各束管连通制成一个大转瓶，此装置因体积大，可放在温室内培养细胞，使转瓶呈水平位置，以4～6转/小时的转速沿纵轴旋转。细胞可在每个玻璃管壁四周贴壁生长。支架上装有一个显微镜，操作者可观察至圆柱管内细胞的生长。pH 可自动调节(通过多岐管龙头加入NaHCO₃)，细胞呈单层后，不能传代，但可用于病毒感染、生产疫苗等。

    生产规模，根据可利用的表面面积划分，有5×10³ cm² 、1×10⁴ cm²及1.5×10⁴cm²。培养液由贮液灌提供，故便于采用灌注培养系统。生产3.2×10⁹Vero细胞(2.3×10⁵/cm²)是在10000cm²的培养系统中使用6.5L的培养液(以50ml/分灌注)培养6天后收获。
后来Gyrogen又进行了改良，将转瓶改用不锈钢圆筒，并备有倾斜支架，显微镜检查和消毒灭菌装置。