细胞大规模培养的类型和方法（10）

  2、悬浮培养的方法：

（1）静置悬浮培养法  此法较容易掌握，细胞是不贴附于壁上，而是以自然沉于瓶底呈游离状态进行增殖，换液时按半量换液法进行，传代时加入等体积的新鲜培基混匀后分瓶培养，如淋巴细胞、类淋巴细胞等。

（2 ）翻滚培养法  此法将试管固定于特别支架的轮面上作翻沟转动，使培养基持续洗刷整个试管壁，从而防止细胞下沉和贴壁，转速为38r/min。其缺点：①细胞易于堆集；②有沉淀物产生；③培养容积小；④缺乏工业化生产的实用价值。

（3）旋转培养法  将培养瓶置于旋转鼓上，使其沿瓶的横轴旋转，为防止细胞贴壁，需将液体培基进行较高速度的旋转。缺点：细胞容易堆集。

（4）旋摇培养法  采用特殊形式将瓶子沿纵轴作来回旋转。缺点：细胞易受机械损伤，发生坏死，也易成团块。

（5）电磁悬搅培养法  采用电磁搅拌器，或包有塑料的磁棒，用不锈钢丝悬挂于瓶内，作细胞悬浮培养，其优点为无泡沫形成，细胞易于适应，无蛋白质沉淀析出。缺点是：易形成细胞团块，易贴壁，培养体积不宜过深，过大。

（6）振荡培养法  将培养瓶放在振荡器上，控制振荡速度，以使细胞在培基中悬浮生长，而且能用于生产病毒和疫苗。

（7）振动器培养法  这种装置的搅拌器是一块锥形孔的板，这块板在培养液中迅速上下移动时，液体由振动板锥形孔宽的一端流向窄的一端，引起压力差，从而产生液体的连续流动，用这种类型的搅动在14升和200升培养器中将哺乳动物细胞的连续流动悬浮培养，结果满意。

（8）滋养器装置  这是一种特殊的连续流动系统，既可用旋转搅拌，也可用振动器，具有温度、pH值、氧压、CO₂压力和流速等控制装置，操作原理是调节细胞密度和流动的营养物质之间的关系，最适条件下可使淋巴细胞在24小时内可产生2克，可连续供应细胞。

（9）发酵罐培养(动物细胞培养生物反应器)：
    自70年代以来，细胞培养用生物反应器有很大的发展，种类越来越多，规模越来越大。种类大致有：塑料袋增殖器、填充增殖器、多板增殖器、螺旋膜增殖器、管式螺旋增殖器、陶质矩形通道蜂窝状增殖器、流化床反应器、中空纤维及其他膜式反应器、搅拌槽反应器、空气提升式反应器等。搅拌槽反应器的搅拌型式大致上有：桨式搅拌器、棒状搅拌器、船舶推进桨搅拌器、倾斜桨叶搅拌器、船帆形搅拌器、往复振动锥孔筛板搅拌器、笼式通气搅拌器、以及华东化工学院开发的双层笼式通气搅拌器等。随着市场对细胞培养产物需求的增加，国外许多公司设计并生产了许多大型细胞培养用反应器，如Celltech公司建立了10,000L规模的生物反应器，培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体，Sumitomo公司建立了8,000L反应器生产t-PA,Wellcome公司建立了8,000L搅拌反应器生产病毒疫苗、干扰素和其它生物制品，加拿大最近从瑞士Bioengineering公司购进4台2,000L反应器生产脊髓灰质炎病毒疫苗。就生产的生物制品价值而言，无疑都是大规模生产。
    反应器的种类通常可按操作模式（即分批或连续）、存在的相（即均相或非均相）或反应器的几何特性（即流动形态和相接触方式）来加以划分。本章介绍的几类生物反应器是已经应用或具有应用前景的细胞培养用反应器。然而开发新型的反应器以适应生产的需要将始终是一项重要的研究任务。

    ①气升式细胞培养生物反应器
    1）气升式生物反应器构型及原理
空气提升式（常简称为气升式）生物反应器是Lefranios于1956年首先开发的。最初被用于生产单细胞蛋白，后来用于培养动植物细胞，特别应用于生产次级代谢产物的分泌型细胞。这种构型的生物反应器与鼓泡塔和搅拌槽生物反应器相比，对细胞产生的湍动温和而均匀，剪切力相当小，器内设有机械运动部件，因而活细胞损伤率比较低，直接喷射空气供氧，氧传递速率高，供氧充分，液体循环量大，使细胞和营养成分能均匀地分布于培养基中。由于空气提升式生物反应器具有上述优点，因此，已被大规模细胞培养法所采用。
空气提升式生物反应器主要有两种构型。一种是内循环式，另一种是外循环式。动物细胞培养一般采用内循环式，但也有的采用外循环式。

    内循环空气提升生物反应器内部有四个组成部分：

    升液区 在反应器中央，曳力管(导流管)内部。若空气是在曳力管底部喷射，由于管内外流体静压差，使气液混和，流体沿管内上升，在反应器上部分离部分气体后，又沿降液管下降，构成一循环流动。若空气在降液管底部喷射，则流体循环方向恰好相反。
    降液区 曳力管与反应器壁之间的环隙，流体沿降液区上升或下降，视喷射空气的位置而定。
    底部 升液区与降液区下部相连区，一般来说，对反应器特性影响不大，但设计不好，对液体流速也有一定影响。
    顶部 是升液区与降液区上部相连区。可在顶端装置气液阀。

    此外，器内还装有环形管气体喷射器，孔的设计要保证在控制的气速范围内产生的气泡，直径为1～20mm，空气流速一般控制在0.01～0.06VVM(进入空气体积，液体体积，分)，反应器高径比一般为3：1～12：1。Siegel曾详细地阐述了空气提升生物反应器的设计和应用。
    Celltech公司首先采用空气提升式生物反应器培养杂交瘤细胞，生产单克隆抗体。1980年为10L规模，1984年放大到100L和200L规模，以后又放到1,000L，到1990年放大到10,000L。逐级放大的基本概念没有改变，主要问题是控制通气速率和混合性能，以达到细胞、氧和营养物质均匀分布。培养工艺是用阶段式系统，先在10L反应器中培养细胞2～3d，再逐级转移到100L和1,000L。阶段式培养系统的优点是能使细胞优化生产。从10L到1,000L培养，共需17天时间，生产单克隆抗体100g。