细胞大规模培养的类型和方法（8）

  3、中空纤维培养法

    中空纤维培养法是模拟脉管在细胞间分布扩散的原理，采用合成的中空纤维制成类似脉管分布扩散系统。此培养系统属于填充床式反应器，培养系统除必备的中空纤维反应器外还需配有培养基贮罐，供氧器及输液管，以便进行灌注培养。各配套设备均用硅橡皮管连通，形成循环回路，操作时，先将细胞接种于中空纤维外表面与反应器内表面之间，然后将保温的培养基，通过输液泵进入反应器，当反应器出口封闭后，培养液自入口处穿过滤膜与细胞接触，并可在出口处穿过滤膜进入出口管内，从而使细胞在流动着的培养基中生长，当反应器出口打开时，与细胞接触过的培养液既可排出反应器，以用于分离产品，也可进入灌注法贮罐，进行环境调整，以使旧培养基再生，然后返回反应器中，提供细胞营养，其优点如下：

  (1)细胞生长密度高，可达10⁸细胞/mL以上，使细胞一直处于接近生理状态的微环境中，可允许细胞以组织样密度生长。

  (2)营养物质可有效分布，代谢废物可及时排除。

  (3)细胞培养可达数月，易于实现连续培养。

  (4)细胞分泌的蛋白质(如激素、单抗、细胞因子等)浓度高，而且细胞合成产品纯度较高，可达60～80%左右，既便于提纯，又可降低成本。

  (5)反应器体积小，不占空间，并可用于培养多种细胞（贴壁或悬浮细胞）。由此可见中空纤维细胞反应器是较有发展前途的培养装置。

    中空纤维一般是作为超滤用，能使大分子通过的海绵状纤维壁，能允许液体连续沿管腔流动，当这些中空纤维包裹在密闭容器中培养细胞时，培养液可被压入，然后通过纤维壁灌注培养系统，供细胞生长，此外，该装置也可为贴壁细胞的生长，提供了很大的表面积。

    毛细管纤维是用丙烯酸聚合物制成。直径为350μm，壁厚75μm，管腔内膜上的孔可截住分子量10000和100000之间的物质，该培养系统可获得很大的表面积与培养体积之比例(大约为30cm²/ml),采用此培养系统可使细胞浓度高达10⁸细胞/ml，此种纤维主要用于悬浮细胞培养，如果改用聚苯乙烯型中空纤维可适合贴壁细胞使用。

    新开发的反应器是把纤维管束横放成平板式浅床，床层深度3～5层纤维管，将若干层浅层床组合在一个容器内。为了使培养基分布均匀，在床层底部引进培养基时，先通过一个2μm微孔不锈钢烧结板分布器，再灌注到床层中。在床层顶部也装置一个20μm微孔不锈钢结板分布器，目的是防止排出的培养基返混。另一种保持培养基均匀分布的方法是在床两端交替灌注新培养基。Endotronics近来在中空纤维管生物反应器作了新的改进，在反应简体外添置一膨胀室，用管路与筒体相连，使培养基浓度梯度和细胞所处的微环境差别减至最小，或者完全排除。中空纤维管生物反应器总的发展趋势是让细胞在管束外空间中生长，用这种方式，能获得更高密度的细胞。

    中空纤维管生物反应器已进入工业生产，主要用于培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体。Bioresponse和Invitron公司均采用这种生物反应器生产单克隆抗体。

    在中空纤维管中生长的细胞型和分泌产物

  (A)生长的细胞类型、宫颈癌细胞HeLa 、小仓鼠细胞 、杂交瘤细胞、肺细胞、中国仓鼠肺细胞、鼠-人杂交瘤细胞、正常二倍体成纤维细胞 BHK-21细胞、人-人杂交瘤细胞、成纤维细胞、CHO细胞、淋巴细胞、小鸡胚胎细胞-原代培养、猴细胞、肝癌细胞、鸭胚胎细胞-原代培养、罗猴肺二倍体细胞、上皮细胞 Vero细胞、绒(毛)膜瘤细胞、胚胎细胞 、罗猴肾MK-2细胞、乳腺瘤细胞 、乳腺组织细胞、大鼠细胞、B-淋巴母细胞、 结肠腺癌细胞、垂体肿瘤细胞、结肠癌细胞、成纤维细胞等。

  4、玻璃珠床反应器

    Whiteside和Spier发明的玻璃珠床流化系统，在100L容器中加入1375（49.5克）个，3mm直径的硅硼玻璃珠占30L，细胞生长的有效面积为200cm²,成功地培养了BHK21、C13细胞及FMDV细胞。要求玻床要压紧，以防止珠床移动，并采用灌注培养法使足够的培养液流过柱床，玻璃珠的性质由表23-8所叙。装置系统图如下图所示。在此培养系统中培养液是由蠕动泵输运的，但使用一个空气驱动系统更合适，这样可得到更多的氧，培养液从上面或下面通过圆柱。
  [实验程序]
  ①以1～2mL/10cm²培养表面面积的速率计算，制备足够的培养基。
  ②使贮液罐与容器间的培养液开始循环，直到这一系统的温度和pH达到平衡（玻璃珠预热到37℃，要有足够的时间）。
  ③将接种细胞（约1×104/cm²）加到与排空体积相等量的培养液中。
  ④从玻璃圆柱流出的液体进入贮存罐，使细胞完全混合，然后加入柱床中。
  ⑤夹住所有管子让细胞向玻珠表面贴壁（3～8小时不等，取决于细胞的类型）。
  ⑥一旦细胞贴壁，便灌注培养液，开始灌注的速率要慢，肉眼观察流出的培养液，如果是烟雾状便证明细胞没有贴壁（如果是此状态要停止灌注，8个多小时后再重新开始）。
  ⑦24小时后灌注培养液的速率可以增加。但要保持在5cm/分钟以下，不然细胞会下脱（特别是有丝分裂的细胞）。pH值以及入口/出口样品葡萄糖浓度的比率都可指示流量率是否足够。
  ⑧细胞的生长可通过测定培养液中葡萄糖含量的变化来判断，也可凭经验找出每种细胞对培养液中葡萄糖的利用率。粗略地估计生产2～5×10⁸细胞，可利用1g葡萄糖。
  ⑨当认为培养物已长满时，排出培养液，用PBS洗玻璃园柱，加入等体积的胰蛋白酶-EDTA，消化15～30分钟后，放出胰蛋白酶，再放回原培养液，给柱床通气，使细胞脱壁，可再扩大培养。
  ⑩使用完毕要及时清洗容器。

  5、包被(埋)细胞培养法

     细胞包被(或包埋)一个半固体基质或球体之中，使细胞固定其内，以避免大规模培养时遭受机械损伤。常用的包被基质有白明胶、多聚赖氨酸、藻酸盐、琼脂糖材料等。常用有孔微载体，商业上有4种类型可以利用，这种载体对贴壁细胞和悬浮细胞都相当适合。有孔微载体优于固体微载体，优点如下：
  (1)单位细胞密度要高20～50倍。
  (2)能支持贴壁细胞和悬浮细胞生长。
  (3)固定的三维空间结构状态容易诱导分化。
  (4)短扩散途径进入球体。
  (5)适合于搅拌、变化流体或固定床反应器各种培养系统。
  (6)能保护细胞不受剪切损害。
  (7)有长期连续培养能力。

    固定床培养是用干燥处理的小球包裹成床，将细胞和培养液混合后，直接加入床内(干燥小球能很好地透进细胞)，需要有较大体积的培养液流动，并使用较快的灌注率(5～20线性cm/分钟)，即1L包裹床至少需15L培养液贮罐。在培养72小时之后每天需加入10L的新鲜培养液。
    表中的变化流动床、类似于固定床装置，细胞首先培养48小时后，再进行灌注培养液，灌注速率为60线性cm/分钟。培养液从床顶部向下流动，再流入贮液罐(体积相当于床体积的20倍)，经环境调节再生后，再送入生物反应器。一种Verax Corpi流动反应器已被采用。这种反应器的培养床为20ml体积，每天通过抽入/收获的培养液为200～1200ml。

    表中的搅拌培养系统。用CultispherG微孔明胶和纤维素(Kirin cellsnow)作微载体，最适合于搅拌生物反应器，而且还可用固体微载体以相同方式进行培养。例如，2g/L微载体行转瓶或搅拌发酵罐培养。因此这种系统可达到高于40倍贴壁培养的细胞浓度以及悬浮细胞培养物。若使微载体释放细胞，可以用胶原酶消化处理。